Cell：对不同体液中小RNA测序以筛选佳的胞外RNA提取方法

exRNA profile会受到不同来源（细胞/组织），不同状态（年龄/健康程度/器官状态）的影响，且由包括外泌体在内的不同的载体运输，加上不同的提取方法和检测技术，均会影响exRNA profile的测定结果。现今的小RNA测序方法已经可以准确地表征exRNA profile，因此合适的exRNA提取方法便关重要。Srinivasan^[1]等通过使用多种exRNA分离方法分离不同位点获得的5种体液中的外泌体，分析结果后总结出了不同体液的适合分离方法。

其中，研究人员使用单个外泌体表型分析技术(Exoview)检测了来源于人血浆的外泌体的蛋白marker表达，判断出血浆外泌体根据蛋白marker主要分为CD63-/CD81+/CD9+和CD63+/CD81+/CD9+两种。

人血浆外泌体蛋白表达分析

参考文献：[1] Srinivasan, S., Yeri, A., Cheah, P. S., Chung, A., Danielson, K., De Hoff, P., ... & Laurent, L. C. (2019). Small RNA sequencing across diverse biofluids identifies optimal methods for exRNA isolation. Cell, 177(2), 446-462.

Brain Behavior and Immunity：脊髓损伤导致血清神经炎症相关纳米颗粒中miRNA与CD81+外泌体水平的改变

脊髓损伤（SCI）会对机体产生系统性影响，导致呼吸、免疫、消化等功能异常，以及相关脑区产生神经炎症和退行性病变。有研究表明，SCI的病理与系统性影响可能与血液来源的因子如外泌体的运输有关；而在中枢神经系统损伤模型中，外泌体可能参与了miRNA等炎性因子运输导致炎症扩散。Khan等^[1]使用包括Exoview外泌体表型分析的多种技术详细表征了SCI建模的小鼠血浆外泌体，发现损伤后外泌体数量、蛋白marker和内容物均有明显的变化，将SCI小鼠的外泌体注射入脑室还可诱发产生炎症。

研究人员使用ExoView检测了SCI血浆外泌体的粒径、数量、荧光强度和共定位（图1A）。外泌体在CD81和CD9区域产生特异性结合而被捕获，而没有CD63捕获。根据干涉成像获得外泌体尺寸分布，其中在50nm多（图1B&C）。荧光成像则检测到了大量干涉成像检测不出的尺寸小于50nm的外泌体（图1D&E），CD81和CD9在大量外泌体上表型出荧光共定位，而CD63荧光则未被检测到，这与图1C结果一致（图1F-H）。相比之下，NTA与流式分析无法检测到尺寸小于50nm的外泌体。

图1 ExoView检测血浆外泌体的粒径、数量、荧光强度和共定位

研究人员进一步比较了SCI组和对照组的血浆外泌体变化，结果表明，在损伤后1d的时间点，CD81外泌体数量相对对照组更高，与Western Blot的结果一致；而CD9外泌体数量则没有统计学差异，与流式分析的结果一致（图2A&B）。基于图2H的CD81与CD9有大量的荧光共定位，检测CD9外泌体的CD81荧光强度，由1d的荧光强度中位数差异可知，

图2 ExoView检测血浆外泌体的粒径、数量、荧光强度和共定位

参考文献：[1] Khan, N. Z., Cao, T., He, J., Ritzel, R. M., Li, Y., Henry, R. J., ... & Wu, J. (2020). Spinal cord injury alters microRNA and CD81+ exosome levels in plasma extracellular nanoparticles with neuroinflammatory potential. Brain, behavior, and immunity.

Cells：CD44糖蛋白在胃癌发生中的作用

CD44是一种跨膜糖蛋白，能够介导细胞间与细胞-基质间相互作用，主要配体为透明质酸（HA）。研究表明，CD44与肿瘤的生长相关，其在肿瘤细胞中高表达，且CD44与HA的结合亲和力高，因此纳米载体常用HA做表面修饰以作为肿瘤细胞的靶向药物载体。外泌体是天然的靶向信息传递载体，有研究在外泌体中检测到CD44。Härkönen等^[1]使用胃癌细胞MKN74研究了CD44表达对外泌体分泌，HA合成与肿瘤细胞生长的影响。结果表明，CD44促进了细胞表面和细胞间的HA形成，调控肿瘤微环境；CD44可改变外泌体的物理性质以及靶向性质。

其中，研究人员使用Exoview检测了MKN74细胞的未经纯化的培养基及分离纯化后的外泌体中的含CD44以及其他标记物的含量。结果表明，相对于对照组，MOCK（CD44敲除）细胞组在未经纯化的培养基及分离纯化后的分泌外泌体的数量显著降低。以上结果表示ExoView可以直接对复杂环境的培养基进行检测，无需分离纯化步骤，且检测结果具有特异性。

ExoView检测表达不同蛋白标记物的外泌体数量

参考文献：[1] Härkönen, K., Oikari, S., Kyykallio, H., Capra, J., Hakkola, S., Ketola, K., ... & Rilla, K. (2019). CD44s assembles hyaluronan coat on filopodia and extracellular vesicles and induces tumorigenicity of MKN74 gastric carcinoma cells. Cells, 8(3), 276.

Cancer Cell Int：外泌体与miRNA调节成神经管细胞瘤的干细胞性

脑瘤中部分细胞具有干细胞特性，能够自我更新并分化为不同细胞系。其中，成神经管细胞瘤的病人有25%经过传统疗法后5年内复发并转移导致死亡，存活的病人也受到化疗和放疗的副作用和并发症影响，因此需要一种安全有效的治疗方法。肿瘤细胞的外泌体含有miRNA，能够调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡等生理过程并与抗药性相关。有研究表明肿瘤干细胞的外泌体运载了肿瘤细胞特有的miRNA，能够产生有利于肿瘤发展的微环境。Choi等^[1]研究了成神经管细胞瘤的外泌体及运载的miRNA及其在肿瘤治疗中的潜在作用。其中，miR-135b和miR-13在肿瘤干细胞中高表达，抑制两者会导致具有肿瘤抑制作用的Angiomotin‑like 2（AMOTL2）表达上升，使肿瘤干细胞的干细胞特性下降。

其中，研究人员使用ExoView通过荧光成像检测肿瘤细胞与肿瘤干细胞的外泌体标记物，在两种细胞的外泌体上均检测到了Alix和Syntenin两种内蛋白，并且可以确定两种内蛋白与CD63/CD9外泌体标记物共定位。

Exoview检测外泌体上的Alix（a）与Syntenin（b）蛋白

参考文献：[1] Choi, S. A., Koh, E. J., Kim, R. N., Byun, J. W., Phi, J. H., Yang, J., ... & Kim, S. K. (2020). Extracellular vesicle-associated miR-135b and-13 regulate stemness in Group 4 medulloblastoma cells by targeting angiomotin-like 2. Cancer cell international, 20(1), 1-14.

外泌体荧光数量统计

外泌体粒径检测

外泌体内容物检测

荧光强度与粒径关系

荧光共定位分析

中国用户已发表文章

☛ 南京大学李靓/张辰宇/张玉婧课题组在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》发表文章。

☛ 上海大学在《Journal of extracellular vesicles》发表文章。

☛  中国科学院深圳技术研究院在《Lab on a Chip》发表文章。

☛  北京天坛医院、国家纳米科学中心、北京航空航天大学在《Advanced Science》发表文章。

☛  同济大学附属上海市肺科医院、上海思路迪转化医学在《Journal of Nanobiotechnology》发表文章。

☛ 山东千佛山医院在《NANO LETTERS》发表文章

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2022-2023发表文章

• Richard J. R. Kelwick …& Paul S. Freemont. (2023) Opportunities to accelerate extracellular vesicle research with cell-free synthetic biology. Journal of Extracellular Vesicles.

• Laurence Blavier …& Yves A. DeClerck. (2023) The capture of extracellular vesicles endogenously released by xenotransplanted tumours induces an inflammatory reaction in the premetastatic niche. Journal of Extracellular Vesicles.

• Hongyun Wang ……& Junjie Xiao. (2022) Extracellular vesicles enclosed-miR-421 suppresses air pollution (PM2.5)-induced cardiac dysfunction via ACE2 signalling. Journal of Extracellular Vesicles.

• Linglei Jiang……& Santosh Dhakal. (2022) A7 bacterial extracellular vesicle-based intranasal vaccine against SARS-CoV-2 protects against disease and elicits neutralizing antibodies to wild-type and Delta variants. Journal of extracellular vesicles.

• Shaobo Ruan, Nina Erwin, Mei He. (2022) Light-induced high-efficient cellular production of immune functional extracellular vesicles. Journal of extracellular vesicles.

• Nasibeh Karimi ……&  Cecilia Lässer. (2022) Tetraspanins distinguish separate extracellular vesicle subpopulations in human serum and plasma – Contributions of platelet extracellular vesicles in plasma samples. Journal of Extracellular Vesicles.

• Heikki Kyykallio ……& Pia R-M Siljander. (2022) A quick pipeline for the isolation of 3D cell culture-derived extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles.

• Roberto Frigerio ……& Marina Cretich. (2022) Comparing digital detection platforms in high sensitivity immune-phenotyping of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles.

• Yael Hirschberg ……& Inge Mertens. (2022) Characterizing extracellular vesicles from individual low volume cerebrospinal fluid samples, isolated by SmartSEC. Journal of Extracellular Vesicles.

• Sukhbir Kaur……& David D. Roberts. (2022) Single vesicle analysis of CD47 association with integrins and tetraspanins on extracellular vesicles released by T lymphoblast and prostate carcinoma cells. Journal of Extracellular Vesicles.

• Simone M. Crivelli……& Erhard Bieberich. (2022) Function of ceramide transfer protein for biogenesis andsphingolipid composition of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles.

• Gi Beom Kim …& In-San Kim. (2023) Harnessing Oncolytic Extracellular Vesicles for Tumor Cell-Preferential Cytoplasmic Delivery of Misfolded Proteins for Cancer Immunotherapy. Small.

• J. Klein, Y. Cao. (2023) Multi-Lipid Synergy In Cartilage Lubrication: Redundancy Or Evolution? Osteoarthritis and Cartilage.

Valerie DeLuca …& Michael E. Berens. (2023) Extracellular vesicles as a pharmacodynamic reporter in glioblastoma. Cancer Research.

• Sarah Pike …& Liya Xu. (2023) Extracellular vesicles in diagnostic retinoblastoma aqueous humor correlate with disease stage and clinical outcome: a pilot study. Cancer Research.

• D. Cookson …& Y. Ashraf Kharaz. (2023) The Biological Response Of Anterior Cruciate Ligamentocytes Following Treatment With Synovial Fluid Extracellular Vesicles. Osteoarthritis and Cartilage.

• Mei Lu …& Yuanyu Huang. (2023) Antitumor synergism between PAK4 silencing and immunogenic phototherapy of engineered extracellular vesicles. Acta Pharmaceutica Sinica B.

• Luke C. McIlvenna ……& Martin Whitham. (2023) Single vesicle analysis reveals the release of tetraspanin positive extracellular vesicles into circulation with high intensity intermittent exercise. The Journal of Physiology.

• Joseph Blommer ……& Dimitrios Kapogiannis. (2023) Extracellular vesicle biomarkers for cognitive impairment in Parkinson’s disease. BRAIN.

• Tyler J ……& Atta Behfar. (2022) Exosome biopotentiated hydrogel restores damaged skeletal muscle in a porcine model of stress urinary incontinence. Npj Regenerative Medicine.

• Min Han ……& Tao Xin. (2022) Three-Dimensional-Cultured MSC-Derived Exosome-Hydrogel Hybrid Microneedle Array Patch for Spinal Cord Repair. Nano Letters.

• Zijian Yang ……& David A. Issadore. (2022) Ultrasensitive Single Extracellular Vesicle Detection Using High Throughput Droplet Digital Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Nano Letters.

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外泌体分析操作流程：仅需7步实现外泌体快速检测